Здобуття премії Президента України для молодих вчених.

Комітет з Державних премій України

в галузі науки і техніки

Державна Установа «Інститут спадкової патології Академії медичних наук України» висуває на здобуття щорічної премії Президента України для молодих вчених цикл досліджень: «розробка та ВПРОВАДЖЕННЯ молекулярно-генетичних методів діагностики спадкових ЗАХВОРЮВАНЬ та поширеної патології людини». Робота виконана Макух Галиною Василівною в Інституті спадкової патології у межах виконання комплексних науково-дослідних робіт на замовлення МОЗ та АМНУ.

Вперше у західному регіоні України розроблено та впроваджено молекулярно-генетичний аналіз ДНК для діагностики патологічних станів людини. Молекулярно-генетичні методи досліджень є високотехнологічними, відповідають світовим стандартам і вимагають високої кваліфікації виконавців. Методики дослідження первинної структури ДНК є на межі сучасних наукових розробок та отримання практичного результату у кожному конкретному досліджуваному випадку.

У результаті проведеної роботи створено банк ДНК пацієнтів із різними захворюваннями та здорових осіб, який на даний час налічує  близько 1700 зразків й постійно зростає.  Налагоджено генетичне тестування 25 поширених мутацій гена ТРБМ (трансмембранний регуляторний білок муковісцидозу), типової мутації R408W гена ФАГ (фенілаланінгідроксилази) при фенілкетонурії, делецій 18 екзонів гена дистрофіну (прогресуюча м`язова дистрофія Дюшенна-Беккера), 5 поширених мутацій гена ATM (атаксія-телеангіектазія), типової мутації 657del5 гена NBN (синдром Ніймеген), мікроделецій Y-хромосоми,  поліморфних варіантів генів фолатного обміну та генів імунної відповіді. Дослідження хвороб хромосомної ламкості – це перші в Україні усесторонні дослідження пацієнтів із порушеннями генів, що задіяні у репарації ДНК. Молекулярно-генетичні дослідження проводяться як у постнатальному, так і в пренатальному матеріалі. Наявний доробок пренатальних досліджень у сім‘ях високого ризику муковісцидозу, синдрому Ніймеген, фенілкетонурії.  Таке практичне застосування ДНК-діагностики дозволяє ефективно здійснювати профілактику нових випадків захворювань, що  спричиняють важку інвалідизацію та ранню смертність у  дітей.

Макух Г.В. ініціювала участь Інституту спадкової патології у міжнародних програмах контролю якості проведення молекулярно-генетичних досліджень. За результатами незалежного тестування рівня діагностики мутацій, асоційованих з розвитком муковісцидозу “European Quality Assessment Scheme for Cystic Fibrosis” (Брюссель, 2005; Брюссель, 2006) отримано сертифікати про його відповідність міжнародним вимогам, що  свідчить про високий кваліфікаційний  рівень виконавців.

Робота «розробка та ВПРОВАДЖЕННЯ молекулярно-генетичних методів  діагностики спадкових ЗАХВОРЮВАНЬ та поширеної патології людини» відповідає вимогам порядку висунення та представлення праць на здобуття щорічної премії Президента України для молодих вчених.

Для чого потрібне медико-генетичне консультування?

·        встановити правильний діагноз
·        оцінити вплив генетичних факторів на виникнення та перебіг хвороби та ризик виникнення хвороби в певних членів родини та при майбутніх вагітностях;
·        усвідомити альтернативи щодо зменшення ризику виникнення хвороби;
·        вибрати найбільш прийнятний спосіб лікування, відповідно до існуючого ризику, етичних, релігійних переконань, мети, що поставила перед собою особа/родина;
·        забезпечити найкращий з існуючих спосіб лікування хвороби і/або дізнатися про способи зниження ризику для майбутніх вагітностей.

За детальнішою інформацією: www.leogene.com.ua 
Лікарі-генетики можуть направляти пацієнтів до спеціалістів вузького профілю, повідомляти їм про існування спеціальних дослідницьких програм, визначати родинні групи підтримки та надавати інформацію про освітні, громадські, соціальні служби і джерела фінансування для осіб з певними хворобами.
 

Результати генетичної оцінки, як правило, повідомляються безпосередньо під час консультації(й), коли лікар-генетик пояснює діагноз, якщо він встановлений, характер та етіологію порушення, передісторію, прогноз, шлях успадкування та рекурентний ризик. Рівень консультації має відповідати освітньому рівню пацієнта. 

Кому рекомендовано проведення аналізу ДНК?

Молекулярно-генетична діагностика повинна проводитися:

· у пацієнтів із підозрою певного спадкового захворювання

· у пацієнтів із клінічними проявами тої чи іншої хвороби

·  в членів родин, де виявлено випадки спадкових захворювань

· у неплідних чоловіків із порушеними показниками спермограми нез’ясованого ґенеза;

· у сімейних пар, яким не встановлено причину первинного чи вторинного безпліддя;

· у вагітних і сімейних пар, без сімейного анамнезу, що повідомлені про ризик спадкових захворювань і хочуть провести ДНК-діагностику.

·  В осіб, які хочуть визначити наявність генетичної компоненти схильності до мультифакторних захворювань (наприклад, схильність до тромбофілії (утворення тромбів))

Основні методи ДНК-діагностики

Полімеразна ланцюгова реакція.

ПЛР – багаторазове копіювання (ампліфікація) певного фрагменту ДНК із допомогою ДНК-полімерази та специфічних олігонуклеотидних ДНК-затравок (праймерів), які є гомологічними кінцям потрібної ділянки ДНК. Цикл ПЛР складається із трьох стадій: денатурації ДНК 2 одноланцюгові молекули; відпалювання – приєднання праймерів до ДНК-матриці; елонгації – добудови другого ланцюгу ДНК у межах праймерних послідовностей. В результаті багаторазового повторювання циклів ампліфікується потрібний фрагмент ДНК у кількості, яку можна спостерігати та аналізувати після електрофорезу.

Аналіз ПЛР-фрагментів ДНК.

Фрагменти ДНК, які були синтезовані в ході ПЛР (копії досліджуваних ділянок ДНК), знаходяться у ампліфікаційній суміші у кількості, яка є доступною для якісної оцінки та аналізу нуклеотидного складу. Оскільки фрагменти ДНК є від’ємно зарядженими молекулами, для їх подальшого анлізу ампліфікаційні продукти фракціонують за їх довжиною (звичайний фрагментний аналіз), або конформацією просторових структур (при DGGE- та SSCP-аналізі) із використанням різних видів електрофорезів. На електрофореграмі частіше за все візуалізують смуги (зони локалізації фрагментів одного розміру або конформації) із допомогою флуоресцентного барвника броміду етидія та реєструють фотографічно в УФ-світлі.

Крім того реєстрація фрагментів ПЛР може відбуватися автоматично за допомогою різних типів аналізаторів флюоресценції (флюориметрів). Для цього необхідно мати ПЛР продукти, які є мічені флуоресцентним барвником із певними спектральними характеристиками, які є вівповідними типу лазерного детектора апиладу. В нашій работі використовувався фрагментний аналіз в горизонтальному агарозному гелі, в неденатуруючому поліакриламідному гелі, в денатуруючому градієнтному (DGGE-гель) та неградієнтному поліакриламідному гелі.

DGGE-аналіз.

Денатуруючий градієнтний гель-електрофорез (DGGE) дозволяє проводити детекцію будь-якої заміни в ланцюгу ДНК (в т.ч. однонуклеотидної), яка утворює легкоплавкий домен. За результатами аналізу розрахунку профілів плавлення доменів для 35 т.п.н. ДНК людини встановлено, що до 50-70% усіх замін пар основ підлягає виявленню (Lerman L.S. et all, 1986). Згідно із методикою DGGE молекули ДНК знаходяться при температурі початку денатурації при якій підлягають електрофоретичному розділенню у ПАА гелі, який містить зростаючий градієнт концентрацій сечовини та формаміду. Фрагменти ДНК, просуваючись гелем, наприкінець потрапляють в таку концентрацію денатурантів, при якій легкоплавкі домени стають нестабільними та швидко плавляться, в результаті чого утворюється частково дисоційована та частково двох ланцюгова структура. Такі молекули просуваються гелем повільніше, або взагалі застрягають. Положення в гелі, при якому рух молекули ускладнюється є унікальним та характеризує кожний певний фрагмент послідовності ДНК. Таким чином, молекули, які відрізняються замінами у легкоплавкому домені можуть бути розділені в такому гелі завдяки різниці в температурі плавлення домену. Описаний метод є скринуючим, оскільки він дозволяє виявити певну ділянку гену, у якій відбулася мутація, проте не дозволяє точно ідентифікувати виявлену мутацію. Для ідентифікації мутації проводять секвенування ділянки гену у якій був зареєстрований змінений електрофоретичний профіль.

ПЛР в реальному часі.

ПЛР в реальному часі (або кількісна ПЛР) – це лабораторний метод, основою якого є ПЛР. Даний метод використовується для одночасної ампліфікації та вимірювання кількості заданої молекули ДНК. Оскільки кинетика накопичення продуктів ампліфікації пов’язана із вихідною кількістю матриці, це дає можливість точно оцінити її кількість (на відміну від фрагментного аналізу звичайної ПЛР, ври якому оцінюємо якісні показники). В результаті вимірювань змін флюоресценції, які в автоматичному режимі відбуваються в реальному часі під час ампліфікації, визначається кількість копій досліджуваної ділянки безпосередньо, або опосередковано відносно внесеній стандартній кількості ДНК чи додаткових калібрувальних генів. За допомогою ПЛР в реальному часі можна також визначати специфічні однонуклеотидні заміни (SNPs). ПЛР в реальному часі не потребує стадії електрофорезу, дозволяє провести повний аналіз проби впродовж 60-120 хвилин та теоретично дозволяє детектувати навіть одну молекулу ДНК або РНК в пробі. Для постановки ПЛР в реальному часі потрібен спеціальний ампліфікатор із можливістю збуджувати та реєструвати флуоресценцію, яка відображує накопичення ампліконів, на кожному циклі ампліфікації.

Для кількісного аналізу використовують два підходи — використання флюоресцентних барвників, які інтеркалюють у дволанцюгові молекули ДНК в процесі ПЛР, та модифікованих дезоксинуклеотидів, які випромінюють світло після гібридизації із комплементарними ділянками ДНК. Спосіб детекції із використанням SYBR Green I базується на тому, що флюоресценція даного барвника значно зростає при його інтеркаляції у дволанцюгові молекули ДНК, що дозволяє спостерігати накопичення продуктів ампліфікації .

 

Рис. 2.1. Схематичне зображення випромінення світла барвником SYBR Green I в реакції ПЛР

Кінетична крива ПЛР у координатах "Рівень репортерної флуоресценції — цикл ампліфікації" має сигмоїдну форму, при чому виділяють три стадії:

1. Стадія ініціації (коли ПЛР- продукти ще не детектуються флуоресцентною міткою – фонова флуоресценція).

2. Експоненціальна стадія (в якій спостерігається експоненціальна залежність кількості флуоресценції від циклу ПЛР).

3. Плато (стадія уповільнення та закінчення накопичення продукту ПЛР).

Цикл при якому спостерігається момент помітного підвищення сигналу та його відриву від фонового – так званий пороговий цикл (Сt) – залежить від вихідної кількості ДНК-матриці. Чим більша кількість ДНК у зразку, тим раніше спостерігають початок росту сигнала флуоресценції та тим меншим є Сt. При визначенні відносної кількості ДНК-матриці або кількості копій досліджуваного гена застосовують формули, які враховують різницю показнику Сt досліджуваної проби по відношенню до цього значення для референтної проби (ΔСt).

Визначення повної нуклеотидної послідовності фрагменту ДНК за допомогою секвенування.

Секвенування – розшифровка нуклеотидної послідовності нуклеїнових кислот (від англ. sequence - послідовність). Існує декілька методів секвенування, проте на сьогодні поширення набуло автоматичне секвенування за класичним методом Сенгера із використанням термінуючих дідезоксинуклеозидтрифосфатів (ddNTP). Так само, як і варіант Сенгера, автоматичне секвенування включає дві стадії: проведення термінуючих реакцій на ДНК-матриці та фракціонування продуктів цих реакцій із використанням електрофорезу. Зазвичай автоматизованою є лише друга стадія. Для автоматичної детекції необхідним є внесення флуоресцентної мітки у продукти сиквенсової реакції. В зв’язку із цим у реакції секвенування додають праймери, які на 5’ кінці мають специфічну мітку, або ddNTP, пов’язані із флуоресцентною міткою. Секвенування проводять на автоматизованих апаратно-програмних системах (секвенаторах), які можуть зчитувати дані на 1 або 4 різних фільтрах для різних флуорофорів.

ДНК-діагностика.

Даний метод є найбільш достовірним методом дослідження спадкових захворювань. Перевага ДНК-діагностики у порівнянні із іншими методами молекулярної генетики людини у тому, що цей метод дозволяє виявити та дослідити саме першопричину захворювання (ген, його локалізація, тип ушкоджень). Цей метод дозволяє виявити навіть мінімальні порушення первинної структури ДНК (в тому числі однонуклеотидні заміни), які неможливо дослідити іншими методами. ДНК-діагностика є малоінвазивною процедурою (достатньо 1-2 мл крові, букального епітелію, або декількох клітин матеріалу плоду, взятого в першому триместрі вагітності). Крім того подібний аналіз у разі виявлення мутації не потребує повторення, достатньо одного дослідження за життя пацієнта та навіть після його смерті.

Цей метод потребує обов’язкової першої стадії – отримання зразку ДНК. Наступний аналіз проводиться в залежності від поставлених задач дослідження.

Основними методами ДНК-діагностики в даній роботі були: полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР), фрагментний аналіз продуктів ПЛР із використанням різних видів гель-електрофорезів ДНК, визначення нуклеотидної послідовності ДНК за допомогою секвенування, ПЛР в реальному часі.